本文目录
- 双缩脲试剂检验蛋白质的原理和条件？
- 双缩脲试剂检测蛋白质的原理？
- 鉴定蛋白质样品时加双缩脲试剂的正确做法是（ ）A．先加A液，混合后再加B液摇匀观察B．先加B液，混合？
- 双缩脲可不可以直接与蛋白质反应？
- 双缩脲试剂检测蛋白质不出现紫色是因为硫酸铜过量对吗？
双缩脲试剂检验蛋白质的原理和条件？
双缩脲法
用于鉴定蛋白质的分析方法
双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。
基本信息
中文名
双缩脲法
外文名
Biuret method
成分
氢氧化钾、硫酸铜、酒石酸钾钠
名词解释
双缩脲反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜，而氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境，因此它可被其他碱，如氢氧化钠所代替。向试剂中加入碘化钾，可延长试剂的使用寿命。
基本概况
实验原理
双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
试剂与器材
1. 试剂：
1.
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2. 器材：
1.
2. 器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
操作方法
1.
标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
双缩脲试剂检测蛋白质的原理？
双缩脲试剂的配制取10g氢氧化钠放入量筒中,加水至100mL,待充分溶解后倒入试剂瓶中,配成质量浓度为0.1g/mL的氢氧化钠溶液,瓶口塞上胶塞,贴上标签,写上试剂A。
取1g硫酸铜放入量筒中,加水至100mL,待充分溶解后倒入试剂瓶中,配成质量浓度为0.01g/mL的硫酸铜溶液(蓝色)。
瓶口塞上胶塞,贴上标签,写上试剂B。检测蛋白质的特异性反应是与双缩脲试剂作用,产生紫色反应.
鉴定蛋白质样品时加双缩脲试剂的正确做法是（ ）A．先加A液，混合后再加B液摇匀观察B．先加B液，混合？
A、用双缩脲试剂鉴定蛋白质时需先加A液，混合后再加入B液摇匀观察，A正确； B、用双缩脲试剂鉴定蛋白质时应先加A液后加B液，B错误； C、使用双缩脲试剂时应先加A液后加B液，使用斐林试剂时要将A液和B液混合均匀后加入，C错误； D、用双缩脲试剂鉴定蛋白质时应先加A液后加B液，D错误． 故选：A．
双缩脲可不可以直接与蛋白质反应？
严格来说，双缩脲试剂不可以直接与蛋白质反应，因为在酸性或者中性条件下，双缩脲试剂不可以直接与蛋白质反应，只有在碱性条件下可以直接反应，如果忽略反应环境是可以反应的，但是严格来讲，也就是不忽略反应环境的情况下，是不可以反应的。 在碱性条件下，由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关。 所以要在碱性条件下，双缩脲试剂与蛋白质反应。
双缩脲试剂检测蛋白质不出现紫色是因为硫酸铜过量对吗？
原理是CuSO4在碱性条件下与具有两个肽键以上化合物反应生成络合物，显紫色。不需要加热进行。注意双缩脲试剂和斐林试剂的区别。
